組み込まれるDNAの向き【遺伝子組換え】　高校生物発展

【 note : https://note.com/yaguchihappy 】 遺伝子組換え（組換えDNA実験）における、DNAの組み込まれる向きについて講義します。最近増えてきたテーマで、難問になりやすいです。 ＊塩基配列の出現確率・制限酵素の認識配列についての講義はこちら↓    • 塩基配列の出現確率・制限酵素の認識配列　高校生物発展   ＊遺伝子組換えについての講義はこちら↓    • 遺伝子組換え（制限酵素・DNAリガーゼ）　高校生物   ＊動画では、たとえば、プラスミド側にプロモーター（転写を開始させる場所。遺伝子を文章にたとえるならプロモーターは「ここから読み始めなさい」という目印）がある場合について解説している（すなわち、今回使用するプラスミドは、DNA断片の挿入部位に隣接してプロモーターを持っているものとする。覚えなくてよいが、このようなベクターは発現ベクターと呼ばれる）。 この場合、プロモーターの位置が決まっているので、組み込んだDNAがどちら側から転写されるかで、できる産物が変わってきてしまう（組み込むDNAの向きが重要になる）。 なお、動画では遺伝子が逆向きに組み込まれ、読まれることを、小説を逆から読むことにたとえているが、二本鎖のDNAが逆向きに繋がった場合、本来読まれるはずのなかった鎖（センス鎖、非鋳型鎖）が鋳型鎖（アンチセンス鎖）となって、読まれる（転写される）ことになる（2本の鎖を、上の鎖と下の鎖と表現すれば、DNAが逆向きに繋がる際、下の鎖が上に来て、上の鎖が下に来ることになる）。つまり、遺伝子が逆向きに組み込まれたとすると（そしてプラスミドにプロモーターがあるとすると）非鋳型鎖が鋳型鎖になってしまうのである。 転写の方向性についての講義はこちら↓    • 転写と翻訳の方向性【セントラルドグマ】　高校生物   問題：ある生物Xの遺伝子Xを大腸菌に組み込む遺伝子組換え実験を行った。 生物XのDNAから、遺伝子Xの配列を１種類の制限酵素で切り出し、同じ制限酵素でベクターとして使うプラスミドも切断した。 その後DNAリガーゼを用いてプラスミドに遺伝子Xを繋いだ。 しかし、別の実験でできた産物の塩基配列を調べてみたところ、プラスミドに遺伝子Xが逆向きに組み込まれてしまっていた。 どのような工夫をすれば、プラスミドに逆向きにDNA断片が組み込まれてしまうことを防げるか。 答え：2種類の制限酵素を使い、DNAの両端に異なる塩基配列が突出するようにする。 解説：遺伝子には決まった方向性がある（「開始コドンのある方ー終止コドンのある方」という方向性がある）。遺伝子（DNA断片）をプラスミドに組み込む際は、方向性にも注意する。 １種類の制限酵素で組み込みたいDNA断片とプラスミドを切った場合、（DNA断片の両末端の切り口[突出した部分の塩基配列]、そしてプラスミドを切ったところの切り口が同じなので）DNA断片が逆向きに組み込まれてしまう可能性がある。面倒だが、２種類の制限酵素を使って、DNA断片の両端の塩基配列を変えれば（そしてプラスミドもその２種類の制限酵素で処理し、切り口をDNA断片が特定の向きに入るようにすれば）、このような失敗はなくなる。 ●　切り口が突出しない末端（覚えなくてよいが、平滑末端という）になる制限酵素もある（たとえばEcoRⅤ[えこあーるふぁいぶ]という制限酵素）。平滑末端の場合は、どのような平滑末端とも繋がる（そのため、意図しない平滑末端と繋がってしまうことも多い。また、一般に、平滑末端同士は、突出した末端[粘着末端、突出末端と呼ばれる]に比べて、結合する効率が悪い）。 ●　遺伝子組換えの際、DNAの切り出しに１種類の酵素しか使わない場合、ベクターに組み込もうとするDNA断片（今回で言うと赤いDNA。大学ではインサートと呼ぶ）同士が結合してしまうこともある。 ＊最後の余談で、制限酵素の認識配列を比較しているが、ふつう塩基配列が同じかどうか確認する時は、3'-5'の方向に気を付けて、塩基配列をひっくり返してみることが大切である。ただ、今回のように制限酵素の認識配列を確認する場合は、ほとんどの場合回文配列になっているから（制限酵素の認識配列は、ひっくり返しても同じ配列になっているから）、簡単に確認できる（いちいちひっくり返す必要はない）。 #高校生物 #バイオテクノロジー #遺伝子組換え